بسمه تعالی

با سلام و ارزوی قبولی طاعات و عبادات

فرارسیدن ایام شهادت امیر مومنان علی (ع) بر همه عاشقان و شیفتگان آن حضرت تسلیت باد.

التماس دعا

مراحل کار توليد متابوليت‌هاي ثانويه در اين‌ويترو:

مراحل کار توليد متابوليت‌هاي ثانويه در اين‌ويترو:

توليد متابوليت‌هاي ثانويه به روش اين ويترو در گيا‌هان مختلف از اصول يکساني تبعيت مي‌کند، که مي‌توان آنها را در مراحل زير عنوان کرد:

1) انتحاب بهترين ژنوتيپ گياهي(Hyper producing plants) :  

            ابتدا از منبع ژرم‌پلاسم گياهي موجود، گياهان با توليد بالا براي متابوليت مورد نظر را به روش‌هاي شيميايي همچون HPLC انتخاب کرده و براي ادامه کار از اين گياهان برتر استفاده مي‌کنند. اگر چه که توليد متابوليت‌هاي ثانويه شديدا القا پذير است و عصاره گرفته شده از اين گياهان، ممکن است که پتانسيل واقعي گياه را براي توليد متابوليت نشان ندهد.

2- انتخاب بهترين لاين‌هاي سلولي(Choies of the best cell lines):

اين مرحله در اصل شروع کارهاي اين ويترو براي توليد متابوليت‌هاي ثانويه گياهي است براي اين کار ابتدا بايد از گياه برتر انتخاب شده در مرحله قبل کالوس‌گيري شود. ابتدا از گياه مورد نظر ريز‌نمونه تهيه کرده اين ريز‌نمونه‌ها مي‌توانند از  اندامهاي خاص  مثل برگ، ساقه و ... باشد، بعد از ضدعفوني کردن ريزنمونه‌ها در محلول هيپوکلريت 1%، ريز‌نمونه‌ها را بر سطح محيط کشت جامد
(MS, LS, B5,…) قرار داده و بعد با تغيير تنظيم‌کننده‌هاي رشد گياهي و نمک‌هاي معدني و ترکيبات آلي محيط کشت و… شرايط اپتيمايز براي رشد کالوس تعيين مي‌شود. يکي ديگر از مطالعات اساسي در مرحله کالوس تعيين لاين‌هاي سلولي با توليد بالا است، اما توده کالوس ابتدايي از يکسري سلول‌هاي غير‌هموژن تشکيل شده است که اين هتروژن بودن در اثر تغييرات سوماکلونالي است که در کالوس اوليه به دليل تغييرات ناگهاني که در شرايط محيطي رشد سلول‌ها صورت گرفته، ايجاد مي‌شود.

 بر اساس مطالعات مختلفي که صورت گرفته است ثابت شده است که با چندين مرحله ساب‌کالچر‌گيري از کالوس اوليه مي‌توان به توده کالوسي رسيد که ادعا کرد که از يک توده سلولي هموژن تشکيل شده است بطور‌يکه بتوان گفت از يک سلول منفرد ايجاد شده است در ضمن بعد از اين چند مرحله ساب‌کالچر‌گيري توده کالوس از يک ثبات رشدي ثابت و پايدار برخوردار مي‌شود. بنابراين مي‌توان اکنون توده کالوس‌هاي مختلف را براي تعيين بهترين لاين‌هاي سلولي مورد آزمايش قرار داد.  

 3) کشت سوسپانسيون سلولي (Cell suspension culture) :

بعد از تعيين بهترين لاينهاي سلولي، مرحله کشت سوسپانسيون لاينهاي برتر است، در اين مرحله بررسي‌ها بر روي شرايط مناسب کشت در محيط مايع و در درون ظروف ارلن ماير انجام مي‌شود. در حقيقت کشت در ارلن ماير را مي‌توان بعنوان يک ماکت از کشت بيوراکتورها در مقياس بالا در نظر گرفت و مطالعات مورد نظر را در حجم کمتر و با هزينه کمتر انجام داد، مطالعاتي که در اين مرحله انجام مي‌شود شامل، بررسي اثر elicitor (محرک‌ها) مختلف بر روي ميزان توليد متابوليت مورد نظر است، همانطور که در اوايل بحث گفته شد توليد متابوليت‌هاي ثانويه در اثر عوامل محيطي و حمله آفات وبيماريها افزايش مي‌يابد، از اين موضوع در کشت بافت نيز استفاده شده است و محققين اثر عوامل مختلف (elicitors) را همچون استري‌هاي محيطي (سرما، گرما، تغييرات pH ، نور و...) و استرس‌هاي بيوتيک مثل قارچ‌ها، ويروس‌ها را  بر ميزان توليد متابوليت مورد نظر بررسي کرده‌اند. نتايج قابل توجهي از بکارگيري اليسيتور‌ها در محيط اين ويترو بدست آمده است، مثلا بکار بردن قارچ‌ها و يا پروتئين پوششي ويروس در محيط کشت يک افزايش چشمگير در توليد متابوليت داشته است بطوريکه در بررسي انجام گرفته بر روي اثر قارچ Ceratocystis fimbtiata بر ميزان توليد furocoumarin در گياه Pastinaca sativa ، يک افزايش توليد تا 20 برابر گزارش شد و در هنگام بکارگيري اليسيتور‌هاي محيطي مثل درجه حرارت و pH افزايش توليد تا 4 برابر گزارش گرديد.

يکي ديگر از روشهاي موثر در افزايش توليد متابوليت مورد نظر در سيستم کشت مايع استفاده از موادي (alginate, carraghenans,etc.) است که باعث ساکن شدن سلولها در محيط کشت مي‌شود که به اين روش Immobilization گويند منحي رشد سلولها در محيط مايع از يک شکل سيگمائيدي پيروي مي‌کند بطوريکه شامل سه مرحله مي‌شود در مرحله اول رشد کند است که مربوط به فراهمي آنزيمي و تشکيل مواد اوليه براي رشد بعدي است در مرحله دوم که يک رشد سريع را شامل مي‌شود مربوط به مرحله تقسيم سلولي است که در اين مرحله سلول مواد اوليه موجود در سلول را براي توليد متابوليت‌هاي اوليه و تقسيمات سلولي صرف مي‌کند در اين مرحله توليد متابوليت ثانويه بسيار کم است در مرحله سوم که باز سرعت رشد از يک مقدار کم برخوردار مي‌شود سنتز متابوليت‌هاي ثانويه افزايش يافته و توليد متابوليت اوليه کاهش مي‌يابد. Immobilization باعث مي‌شود که مرحله دوم از مقدار کمتري برخوردار شود يعني باعث مي‌شود که سلول ها در کنار هم قرار گرفته و ميزان تقسيمات سلولي کاهش يافته در نتيجه مقدار کمتري از مواد داخل سلول صرف توليد متابوليت‌هاي اوليه شده و سلول مي‌تواند آنها را در مرحله بعد صرف توليد متابوليت ثانويه مورد نظر کند، دليل ديگري که براي افزايش توليد متابوليت ثانويه در اثر استفاده از مواد ثابت کننده ذکر مي‌شود اين است که اين مواد يک حالت تمايز يافتگي به سلول ها در محيط کشت مي‌دهد در نتيجه توليد يکسري از متابوليت‌ها ثانويه که با افزايش تمايز کشت‌هاي گياهي رابطه مستقيم دارد، بيشتر مي‌شود.

 نکته‌اي که اينجا اهميت دارد اين است که توليد متابوليت ثانويه تحت تاثير دو عامل است، مقدار بيومس و غلظت متابوليت در واحد کشت. بنابر‌اين استفاده از Immobilization در کشت نبايد بصورتي باشد که مقدار بيومس را خيلي تغيير دهد، يعني اينکه بايد اينکار شامل دو مرحله باشد، در مرحله اول بايد اجازه رشد را به توده سلولي داده و هنگامي که مقدار رشد به يک حد مناسب رسيد آنگاه در مرحله بعد از مواد ثابت کننده استفاده شود تا رشد را کاهش داده  و غلظت متابوليت ثانويه را در سلول افزايش دهد. در بررسي‌هاي انجام شده نشان داده شده است که استفاده از مواد ثابت کننده رشد، باعث افزايش دوره توليد فعال متابوليت ثانويه مي‌شود بطوريکه در توليد سولاسودين در گياه Solanum avicular با استفاده از مواد ثابت کننده رشد توانسته‌اند توليد فعال متابوليت را تا 30 هفته ادامه دهند در حالي که در حالت عادي اين دوره حدود 3-4 هفته است. بررسي‌هاي ديگري همچون اثر اضافه کردن پيش ماده به محيط کشت و... برميزان توليد را نيز در اين مرحله مي‌توان اندازه‌گيري کرد.

همانطور که گفته شد مطالعات زيادي بر روي توليد متابوليت ثانويه در گياهان انجام شده است اما تعداد توليد تجاري اين ترکيبات بسيار کم است، يکي از دلايل آن غلظت پايين اين ترکيبات در کشت‌هاي سلولي است. توليد بعضي از اين ترکيبات با افزايش سطح تمايز يافتگي بافت، افزايش مي‌يابد، بنابر‌اين آمده‌اند براي رفع اين مشکل از کشت‌هاي تمايز يافته مثل ريشه موئين و کشت اندام‌هاي هوايي استفاده کرده‌اند که اين اندام‌ها را براي توليد بيشتر مي‌توان تراريخت کرد، بدين ترتيب که بعد از تعيين گياهان با توليد بيشتر متابوليت مورد نظر، از قسمت‌هاي مختلف گياه ريزنمونه تهيه کرده و بعد از ضد عفوني کردن، ريزنمونه‌ها را با روشهاي مختلف، بيشتر با استفاده از باکتري Agrobacterium ، تراريخت کرده. در صورت استفاده از A.rhizogenes باعث القا ريشه‌هاي موئين در ريز‌نمونه شده که اين ريشه‌هاي موئين را به محيط‌هاي کشت مايع در ارلن ماير برده و با انجام آزمايشات مختلف لاين‌هاي ريشه موئين با توليد بالا را انتخاب کرده و براي کشت بيوراکتور استفاده کرده. در صورت استفاده از A. tumefaciens ايجاد اندام هوايي تراريخت (Shooty teratoma lines) با توليد بالا متابوليت شده که با انتقال به کشت‌هاي مايع در ارلن ماير، ديگر مطالعات مربوطه صورت گرفته و بعد نوبت به مطالعات در بيوراکتور مي‌رسد. 

 4- مطالعات در بيوراکتور (Bioreactor studies) :

بعضي بررسي‌ها را در کشت ارلن ماير نمي‌توان انجام داد، همچون بررسي فراهمي مواد اوليه براي کشت‌ها در مقياس بالا، مثلا در کشت بيو‌راکتور ما با مسئله اکسيژن رساني براي توده بزرگ از کشت مواجه هستيم، که اين موضوع کمتر در کشت‌هاي درون ارلن ماير به دليل حجم کم، حائز اهميت است. بايد در کشت بيوراکتور با طراحي‌هاي خاص اين موضوع را حل کرد، که عموما بوسيله پمپ کردن اکسيژن يا استفاده از همزن و يا استفاده از لوله‌هايي که هوا را در درون محيط کشت جريان مي‌دهد اين مشکل را بر طرف مي‌کنند. مسئله ديگري که در کشت در حجم بالا اهميت دارد فراهمي محيط کشت براي بافت مورد کشت است مثلا در کشت ريشه موئين بدليل اينکه رشد ريشه بصورت کروي است ريشه‌هاي قديم در داخل و ريشه‌هاي جديد در سطح قرار مي‌گيرند، بنابراين ريشه‌هاي قديمي نسبت به ريشه‌هاي جديد از يک موقعيت يکسان براي دسترسي به مواد غذايي برخوردار نيستند، براي رفع اين مشکل بيوراکتورهايي طراحي کرده‌اند که محيط کشت را با فشار بر سطح ريشه موئين‌ها مي‌پاشد. در کشت اندامهاي هوايي به دليل اينکه سلول‌ها داراي کلروفيل هستند براي توليد بيشتر متابوليت مورد نظر بايد اين کشت‌ها در معرض نور باشند، بنابراين بدنه (مخزن) اين بيوراکتورها بايد از جنسي طراحي شود که نور بتواند به سلول‌ها برسد. مسئله ديگر در کشت در مقياس بالا جداسازي و تخليص متابوليت مورد نظر است، بسته به محل توليد و ذخيره متابوليت (بعضي متابوليت‌ها در واکوئل ذخيره شده بعضي در سيتوپلاسم وبعضي در فضاي بين سلولي و...) و يا طبيعت شيميايي و مولکولي متابوليت از روشهاي مختلف براي جداسازي استفاده مي‌کنند، همچون، electropermeabilization, chemical permeabilization, ulterasounic method, heat sock, pH gradient  و ... استفاده مي شود.