کاربرد بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک در گیاهان دارویی

 مقدمه

امروزه مهمترین هدف از انجام کارهای اصلاحی در گیاهان بهبود وضعیت تولید و بهره وری از اندام مصرفی این گیاهان می باشد در زمینه اصلاح گیاهان دارویی آنچه که در اولویت اهداف اصلاحی قرار می‌گیرید ارتقاءکمیت و کیفیت ترکیبات متابولیتی ومواد موثره موجود در اندام این گیاهان می‌باشد . روشهای اصلاحی در گیاهان دارویی بطور کلی به دو دسته سنتی (انتخاب توده‌ای ,دورگ‌گیری و زراعت متابولیتی) و مدرن (تغییر در ساختار ژنتیکی) طبقه‌بندی می‌شوند.استفاده از مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی متابولیتهای ثانویه شامل ایجاد جهش ,انتقال ژن (استفاده از باکتری اگروباکتریوم‌‏‏، تفنگ ژنی)دستکاری تنظیم کننده‌های نسخه برداری ژنها و کشت‌های درون شیشه ای می باشد که نتیجه این تکنیک ها ایجاد گیاه ترانس ژنیک و زراعت مولکولی گیاهان دارویی خواهد بود . 

 تغيير ژنتيكي

پيشرفت هاي اخير در ژنتيك گياهان و تكنولوژي DNA نوتركيب به پيشرفت وبالا بردن تحقيقات در مورد بيوسنتز متابوليت هاي ثانويه كمك ميكند .يك خط اصلي در تحقيقات آنزيم‌هاي مسير متابوليك را مشخص مي‌كند وسپس اين آنزيم ها رابراي كنترل بهتر آن مسير تغيير ميدهد . انتقال بطور صحيح براي تغيير ژنتيكي بيش از 120 گونه از 35 خانواده شامل محصولات عمده اقتصادي، سبزيجات ،‏گياهان زينتي ، دارويي، ميوه، درخت وگياهان مرتعي با استفاده از آگرو باكتريوم يا روشهاي مستقيم بكار رفته است . اگر چه انتقال بواسطه اگروباكتريوم مزيت هاي مختلفي را بر روشهاي انتقال مستقيم (بمباران ذرهاي ـالكتروپوريشن وغيره )ارائه مي دهد.از قبيل امكان انتقال تنها يك يا تعداد كمي كپي قطعه DNA كه ژنهاي مورد نظر با مزيت بالاو قيمت پايين و انتقال قطعه DNA خيلي بزرگ با بازآرايي خيلي پايين .

باكتري گرم منفي خاك  Agrobacteriom tumefacienseو گونه مشابه Agrobacteriom rhizogenese بترتيب عامل بيماري تومور گال طوقه وريشه مويي گياهان است .اين گونه ها كه متعلق به ريزوبياسه Rhizobiaceae هستند .مهندسين طبيعي هستند كه قادربه انتقال يا تغيير ژنتيكي گياهان مهم دولپه‌اي است، اگر چه گزارشهايي از آلودگي گياهان تك لپه اي هم وجود دارد . نژادهاي آلوده كنندهءAgrobacteriom tumefaciense و A.rhizogenese  حاوي پلاسميد خيلي بزرگ (بيش از kb 200) هستند كه نقش كليدي در القاي ايجاد تومور بازي مي‌كند و به اين دليل پلاسميد Ti يا Riدر مورد A.rhizogenese نام گرفته است .

در طول آلودگي T _DNAيك قطعه همراه يا متحرك پلاسميد Ti ياRi بدرون هسته سلول گياهي وارد مي‌شود وبدرون كروموزوم گياه تلفيق مي‌شود .  T_DNA, A.tumefaciense را بدرون هسته سلولهاي آلوده شده كه سپس آن هم بدرون ژنوم ميزبان تلفيق شده و استقرار مي يابد‌و ترجمه شده و باعث بيماري گال طوقه مي‌شود(3و4).  ‌‌  T_DNA حاوي دو نوع ژن است: ژنهاي سرطاني كه براي آنزيم‌هايي كه در سنتز اكسين ها و سيتوكينين ها لازمند و مسئول تشكيل تومور هستند كد مي‌كنند‌و‌ژنهايي كه براي سنتز اپين ها كد مي‌كنند.

Agrobacteriom rhizogenese بطور مرتب براي انتقال ژن در بسياري از گياهان دو لپه اي بكار مي‌رود (2). گياهاني كه با اين باكتري آلوده مي شوند تشكيل ريشه‌هاي نابجاي چند شاخه اي تكثير شونده را در محل آلودگي تحريك مي‌كنند كه به آنها ريشه‌هاي مويي گفته مي‌شود. اين انتقال بدنبال انتقال بخشي از DNA  مانند T_DNA كه به عنوان پلاسميد القا ريشه(Ri_plasmid) شناخته مي‌شود به درون DNA كروموزومي سلول گياه انجام مي گيرد.

تحقيقات به سمت كاربرد انتقال و تغيير ژنتيكي گياهان با استفاده از Agrobacteriom rhizogenese  براي بالابردن توليد متابوليت هاي ثانويه آنها كه بطور طبيعي در ريشه هاي گياه مادر سنتز مي‌شوند پيش مي‌رود . ريشه هاي مويي تغيير شكل يافته از سازمان بيوشيميايي حاضر پيروي مي‌كند و در ريشه ها ي نرمال ودر بسياري از نمونه هاي تغيير شكل يافته فعال است .ريشه هاي مويي عملكرد توليد بيشتري نشان مي‌دهند .تغيير ژنتيكي براي گياهان دارويي  گزارش شده است Naina و دیگران  باززایی  موفقیت آمیز گیاهان تراریخت(Azadrakhta indica )neem با استفاده از ‌Agrobacteriom tumefaciense حاوی مشتقات پلاسمید نوترکیب A6pTi گزارش کرده اند.تغییرژنتیکی  Atropa   beladona با کاربرد A.tumefaciense با اصلاح ترکیبات آلکالوئیدی گزارش شده است. تغییر ژنتیکیEchinavea purpurea بواسطه A.tumefaciense باکاربرد نمونه های برگ اثبات شده است . تغییر ژنتیکی ابزار قدرتمندی برای افزایش تولید متابولیت های ثانویه جدید با عملکرد محدود شده است .ریشه های مویی تغییرشکل یافته با  A.rhizognese برای تولید متابولیت های ثانویه بدلیل ثبات مداوم و تولید یالادر شرایط کشت بدون هورمون مناسب هستند. تعدادی از گونه های گیاهی شامل بسیاری از گیاهان دارویی با موفقیت با  A.rhizogenese تغییر یافته اند .در سیستم کشت ریشه های مویی گیاه دارویی Artemisia annua  که بوسیله A.rhizogenese  آلوده شده بود غلظت بهینه  mg/L  Artimisin 8/4 بود.Giri  و همکاران توسعه ریشه های مویی را در Aconitum hetrophyllum با کاربرد A.rhizogenese تحریک کردند. Parade و دیگران سیستمی برای تولید گیاهان تراریخت از نمونه های ریشه ’Digitalis lanata توسعه دادند.آنها نژادهای وحشی مختلف A.rhizogenese را برای تولید متابولیت های ثانویه بدست آمده از ریشه های مویی گیاهان تغییر یافته (تراریخت) ارزیابی کردند.آنها مقادیر بالاتر anthraquinenes و فلاونوئیید‌ها را در ریشه های مویی تراریخت د ر مقایسه با ریشه های غیر تغییر یافته گزارش کردند.در یک سند پیش نویس موثر برای توسعه کشت ریشه (papaver somniferum) opium poppy و (Eshscholazia californica. cham) californica poppy   تراریخت استفاده از Ag.Rhizogenese گزارش شده است.

Bonhomme و دیگران تولید tropan alkaloid   را بواسطه ریشه های مویی Atropa belladonna بدست آمده بعد از تغییر ژنتیکی با A. rhizogenese گزارش کرده اند.Argola   ودیگران تنظیم تولید solasodine ریشه های تغییر یافتهءsolanum aviculare   توسط A.rhizogenese را گزارش کرده اند.Souret و دیگران اثبات کرده اند که ریشه های تراریخته A. annua نسبت به تمام گیاهان در تولید محصول سزکویی ترپن آرتمیزینsesquiterepen artemisinin   برتر است.Shi & Kintzios تغییر ژنتیکی ‍Pueraria phaseoloide با A.rhizogenese و تولید puerarin در ریشه های مویی را گزارش کرده اند . محتوی puerarin  در ریشه های مویی به سطح  mg/g 2/1 ماده خشک می‌رسد  درحالی که در ریشه های گیاهان تغییر نیافته در زمان مشابه محتوی آن mg/g 067/1 بود . بنابراین ریشه‌های تغییر یافته پتانسیل بزرگی به عنوان یک منبع تجاری پایدار برای متابولیت های ثانویه دارند.

تغییر ژنتیکی ممکن است سیستم موثری برای تولید درون شیشه ای متابولیت های ثانویه فراهم کند . پیشرفت سیستم های کشت سلول درون شیشه پتانسیل خوبی برای بهره برداری تجاری از متابولیتهای ثانویه است. پروتکل‌های کشت بافت برای گیاهان مختلف توسعه یافته اند اما گونه های زیادی وجود دارد که در صنایع دارویی استفاده بالایی دارند و نیاز به حفاظت دارند.

 جهش مصنوعي

يكي از عوامل اصلي تكامل در گياهان جهش يا موتاسيون است اصلاح نباتات بر پايه تنوع و گزينش بناشده است. همراه با دورگ گيري و بيوتكنولوژي ،جهش با ايجاد تنوع مواد اوليه براي گزينش را فراهم مي كند. از جهش در اصلاح نباتات استفاده زيادي شده است و تعداد زيادي واريته جديد از اين طريق اصلاح يافته اند .براي ايجاد جهش مي توان از جهش زا هاي فيزيكي مثل پرتوهاي گاماو ايكس و جهش زاهاي شيميايي مثل اتيل متيل سولفونات ،دي‌متيل‌سولفات و غيره استفاده كرد .با استفاده از تكنيك‌هاي به نژادي مثل جهش مصنوعي امكان اصلاح گياهان دارويي با عملكرد و ماده موثره بالا عملي است. سرعت اصلاح در اين روش به ويژه براي گياهاني كه با بذر تكثير مي‌شوند بيشتر خواهد بود.

 تولید متابولیت های ثانویه

توليد متابوليت‌هاي ثانويه در كشت معلق سلول‌هاي گياهان داروئي متعدد گزارش شده است. براي مثال: توليد Solasodine  از كالوس‌هاي Solanum eleagnifolium  و آْلكالوئيدهاي Pyrrolizidine از كشت ريشه گونه‌هاي Senecio sp.(5). سفالين Cephaelin و Emetine از كشت كالوس Cephaelis ipecacuanha جدا شده‌اند. Scragg و همكارانش آلكالوئيدهاي Quinoline را در مقادير قابل توجهي از كشت معلق سلول‌هاي كروي Cinchona ledgeriana  جدا كردند. افزايش بيوسنتز ايندول آلكالوئيد در كشت معلق Catharanthus roseus نيز گزارش شده است(4).

Ravishankar و Grewal گزارش كردند كه اجزاي محيط كشت و استرس‌هاي عناصر غذايي توليد Diosgenin را در كشت كالوس‌هاي Dioscorea deltoidea   تحت تاثير قرار دادند(6). Parisi و همكارانش عملكردهاي بالايي از آنزيم‌هاي Proteolytic  از كشت بافت كالوس سير (Allium sativum L.) بر روي محيط كشت MS كامل شده با NAA وBAP بدست آوردند. Pradel  و همكارانش مشاهده كردند كه بيوسنتز Cardenolides در كشت تارهاي كشنده Digitalis lanata در مقايسه با برگ‌ها بيشتر بود. نشان داده شده است كه توليد Azadirachtin و Nimbin در شاخه‌ها و ريشه‌هاي كشت شده Azadirachta indica در مقايسه با گياهان پرورش يافته در مزرعه زياد است. Pande  و همكارانش گزارش كردند كه عملكرد Lepidine در Lepidium sativum Linn. بستگي به منبع و نوع ريزنمونه دارد(4،7).

بيوراكتورها گام كليدي در توليد تجاري متابوليت‌هاي ثانويه توسط بيوتكنولوژي هستند. بيوراكتورها چندين مزيت براي كشت انبوه سلول‌هاي گياهي دارند:

1- كنترل بهتري براي افزايش كشت معلق سلول ها تحت پارامترهاي مشخص شده براي توليد تركيبات فعال زيستي مي‌دهد.

2- تنظيم دائمي شرايط در مراحل متعدد اداره بيوراكتور امكان‌پذير مي‌باشد.

3- تيمار كشت مانند تلقيح يا برداشت آسان است و از اتلاف زمان جلوگيري مي‌كند.

4- جذب عناصر غذايي توسط شرايط كشت غوطه‌ور شده افزايش مي‌يابد كه افزايش مقدار و عملكرد تركيبات فعال زيستي را تحريك مي‌كند.

5- تعداد بيشتري گياهچه به آساني توليد مي‌شود و مي‌توانند افزايش يابند.

از آنجايي كه كارآيي بيوسنتز جمعيت‌ها تغيير مي‌كند، براي شروع بايد يك واريته با عملكرد بالا انتخاب شود. نياز اساسي در همه اين مراحل عملكرد خوب تركيب و كاهش هزينه در مقايسه با سنتز طبيعي توسط گياهان است.

مقادير قابل توجهي از Sanguinarine در كشت معلق سلول‌هاي Papaver somniferum با استفاده از بيوراكتورها توليد شده است. كشت با‌‌‌‌‌فت ريشه‌هاي Ginseng در يك بيوراكتور20 تني mg/l/day500 از Saponin را توليد كرد كه به عنوان عملكرد بسيار خوب مطرح مي شود. Jeang  و همكارانش فرآورده انبوه تارهاي كشنده تغيير شكل يافته Panax ginseng را در بيوراكتور ايجاد كردند (2). Hahn  و همكارانش توليد Ginsenoside را از كشت ريشه‌هاي نابجايPanax ginseng از طريق سيستم بيوراكتور بزرگ مقياس (10-1 تن) مشاهده كردند.